C2238 / αanp يعدل البروتين البروتيني e من خلال egr-1 / mir199a في خلايا العضلات الملساء الوعائية في المختبر | موت الخلايا ومرضها

C2238 / αanp يعدل البروتين البروتيني e من خلال egr-1 / mir199a في خلايا العضلات الملساء الوعائية في المختبر | موت الخلايا ومرضها

Anonim

المواضيع

  • تصلب الشرايين
  • إشارات الخلية
  • التعبير الجيني
  • البروتينات الدهنية

نبذة مختصرة

الأشخاص الذين يحملون متغير الجينات T2238C ANP يكونون أكثر عرضة للإصابة بسكتة دماغية أو احتشاء عضلة القلب. يجب توضيح الآليات التي تمارس من خلالها T2238C / α ANP تأثيرات الأوعية الدموية الضارة. في هذا العمل ، استهدفنا استكشاف تأثير C2238 / α ANP (شكل متحولة) على المسارات المرتبطة بتصلب الشرايين. كخطوة أولى ، تم إجراء تحليل ماكرراي للتعبير الجيني للتعبير الوراثي في ​​خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) المعرضة إما لـ T2238 / α ANP (النوع البري) أو C2238 / α ANP. كان الاكتشاف الرئيسي هو أن التعبير الجيني لـ apolipoprotein E ( ApoE ) قد تم تنظيمه بشكل كبير بواسطة C2238 / α ANP وتم تنظيمه بواسطة T2238 / α ANP. وجدنا فيما بعد أن C2238 / α ANP يحث على تقليل تنظيم ApoE من خلال مستقبلات الببتيد الناتريوتريك من النوع C (NPR-C) - آليات تعتمد على إعادة تنظيم miR199a-3p و miR199a-5p و downregulation of DNAJA4. في الواقع ، أنقذت ضربة قاضية NPR-C مستوى ApoE. تم التوسُّع في miR199a بواسطة NPR-C بواسطة زيادة تعتمد على أنواع الأكسجين التفاعلية في عامل النسخ المبكِّر لاستجابة النمو البروتيني -1 (Egr-1). في الواقع ، ألغت ضربة قاضية Egr-1 تأثير C2238 / α ANP على ApoE و miR199a. تجدر الإشارة إلى أن تقليل تنظيم ApoE بواسطة C2238 / α ANP كان مرتبطًا بزيادة ملحوظة في الالتهاب ، موت الخلايا المبرمج والنخر الذي تم إنقاذه تمامًا من خلال الإدارة الخارجية لـ Apo المؤتلف. في الختام ، كشفت دراستنا آلية جديدة للتلف الأوعية الدموية التي تمارسها C2238 / α ANP التي يتوسط فيها ApoE downregulation. نحن نقدم أول دليل على أن C2238 / α ANP ينظم ApoE في VSMCs من خلال التنشيط المعتمد على NPR-C من Egr-1 وما يترتب على ذلك من تنظيم miR199a. يمكن أن تمثل استعادة مستويات ApoE استراتيجية علاجية محتملة للتصدي للآثار الضارة لـ C2238 / α ANP.

الأساسية

يلعب الببتيد الأذيني الناتري (ANP) وظائف القلب والأوعية الدموية المهمة ، مثل التأثيرات الخافضة للضغط ، ومضادة التكاثر ، والخاصية في خلايا عضلية القلب ، وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) والخلايا الليفية والخلايا البطانية. 1 أوضحت الأعمال الحديثة أن البديل الجزيئي لـ α ANP (C2238 / α ANP) ، والذي يتميز بالتمديد C الطرفي للببتيد مع اثنين من بقايا الأرجينين وهو ثانوي لاستبدال ثيمين لسيتوزين في الموضع 2238 من الجين ANP ، يمارس تأثيرات الأوعية الدموية الضارة. في الواقع ، لقد أظهرنا نحن ومجموعات أخرى من قبل أن الأشخاص الذين يحملون متغير الجينات T2238C ANP لديهم مخاطر أعلى بشكل كبير للإصابة بسكتة دماغية أو احتشاء عضلة القلب وعرض زيادة ملحوظة في علامات الدورة الدموية لتنشيط الكريات البيض. 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 بشكل عام ، يبرز هذا الدليل الحاجة إلى إيجاد أهداف علاجية لمنع أو تقليل الآثار الضارة المترتبة على متغير الجينات C2238 / α ANP ، وهو أمر شائع نسبيًا في عموم السكان. ومع ذلك ، يكون هذا ممكنًا فقط إذا كانت الآليات الجزيئية التي من خلالها C2238 / α ANP تفضل تطوير اختلال وظيفي في الأوعية الدموية وتصلب الشرايين وحوادث القلب والأوعية الدموية.

لقد أبلغنا سابقًا أن البديل الجزيئي C2238 / α ANP يعزز موت الخلايا المبرمج الخلوي والنخر والإجهاد التأكسدي ، في حين أنه يقلل من تكاثر الخلايا وتولد الأوعية وتوسع الأوعية. 9 ، 10 ، 11 ميكانيكيا ، وجدنا أن الآثار الضارة المترتبة على متغير C2238 / α ANP تتم بوساطة تنشيط غير منظم لنوع مستقبلات الببتيد الناتريوتوري من النوع C (NPR-C) مع ما يترتب على ذلك من انخفاض في مستويات cAMP ونشاط PKA. 10 ، 11 وجد أن التنشيط غير الطبيعي لـ NPR-C مرتبط بتقليل مسار Akt / eNOS وزيادة في نشاط أنواع الأكسجين التفاعلي المشتق من أوكسيديز (ROS) في الخلايا البطانية. 9 ، 10 بالإضافة إلى ذلك ، ساهمت ظاهرة اللاجينية التي تنطوي على miR21 بشكل كبير في الآثار الضارة لل C2238C / α ANP على بقاء الخلية وظيفة في VSMCs. 11 ومع ذلك ، يمكن لهذه الآليات الجزيئية أن تفسر فقط الخصائص الضارة لـ C2238 / α ANP على ثبات تصلب الشرايين. من ناحية أخرى ، فإن تفاعل C2238 / α ANP مع جينات / بروتينات متعددة مرتبطة مباشرة بعملية تصلب الشرايين لا يزال مجهولا. ويدعم هذا الاحتمال الأخير من خلال مشاركة معروفة من الببتيدات الناتريوتريك في تصلب الشرايين. 1

لهذا السبب ، أجرينا تحليلًا لتصوير الجين في التعبير VSMCs ، وهو عنصر خلوي رئيسي في تطور تصلب الشرايين 12 وهدفًا من ANP ، 1 من أجل التحقيق في التأثير المحتمل لـ T2238C / α ANP على الآليات الكامنة وراء تصلب الشرايين. لقد وجدنا أن C2238 / α ANP يستحث تنظيمًا هامًا للتعبير عن التعبير الجيني لـ apolipoprotein E ( ApoE ) ، مشفرًا بروتين معروف مضاد للتجلط ومضاد للالتهابات ، من خلال تنشيط مسار NPR-C / Egr-1 / miR199a / DNAJA4 نحن تشريح هنا لأول مرة. تم العثور على downoulation apoE لتكون مسؤولة عن التشوهات الخلوية الضارة الناجمة عن T2238C / α ANP في VSMCs.

النتائج

تعبير جيني ApoE التفاضلي في VSMCs الناجم عن TT2238 / α ANP و CC2238 / α ANP

في الجدول 1. تم توضيح الملف التعريفي لجينات تصلب الشرايين لخلايا العضلات الملساء الوريدية البشرية (HUVSMCs) المعرضة إما لـ TT2238 / α ANP أو CC2238 / α ANP ، مقارنة بالخلايا غير المحركة ، في الجدول 1. من بين المتواليات التي تم تنظيمها بشكل كبير وتفاضلي (على الأقل 5 أضعاف) في شكلين α ANP ، تم تقليل جين ApoE بشكل كبير بحلول CC2238 / α ANP ، في حين تم تحفيزه بشكل ملحوظ بواسطة TT2238 / α ANP. قمنا بالتحقق من صحة نتائج macarray من خلال توضيح أن كلا من ApoE mRNA ومستويات التعبير عن البروتين قد تم تنظيمها في كل من HUVSMCs (الأشكال 1A و b) و SMCs الشريان التاجي (CAMSCs) (الأشكال 1C و d) بواسطة CC2238 / α ANP ، في حين تم TT2238 / α ANP. نظرًا لأنه من المعروف أن ApoE تمارس إجراءات هامة مضادة للتصلب العصبي ومضادة للالتهابات ، 13 قررنا تقييم ما إذا كان تقليل تنظيم ApoE يتوسط في التأثيرات الضارة لـ CC2238 / α ANP.

الجدول بالحجم الكامل

Image

التنظيم التفاضلي لمستوى ApoE mRNA ومستويات البروتين بواسطة TT2238 / α ANP و CC2238 / α ANP في HUVSMCs و CAMSCs. نتائج RT-PCR ( a و c ) و النشاف الغربي ( b و d ، مع تحليل قياس الكثافة المقابل) لمستويات التعبير ApoE في HUVSMCs (الجزء العلوي) وفي CASMCs (الجزء السفلي). يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​± SD عدد التجارب المستقلة = 6. < P <0.005 لـ TT2238 / α ANP مقابل نسبة النقر إلى الظهور. ** P <0.0001 لـ TT2238 / α ANP مقابل CC2238 / α ANP ( a و b ) و CC2238 / α ANP مقابل كلاً من CTR و TT2238 / α ANP ( b و d ). CC2238 / α ANP ، البديل α ANP ؛ TT2238 / α ANP ، النوع البري α ANP ؛ نسبة النقر إلى الظهور ، التحكم

الصورة بالحجم الكامل

CC2238 / α ANP يستحث تنظيم ApoE من خلال الآليات المعتمدة على NPR-C المرتبطة بتنظيم miR199a

ثم قمنا بتشريح الآليات التي من خلالها CC2238 / α ANP يحث على تقليل تعبير ApoE. أظهر العمل السابق من مختبرنا أن CC2238 / α ANP يستحث آثار الأوعية الدموية الضارة من خلال تنشيط تحرير NPR-C. 10 ، 11 لذلك ، قمنا بالتحقق مما إذا كان NPR-C يتوسط في تأثيرات CC2238 / α ANP على مستويات التعبير ApoE. أكدت نتائجنا هذه الفرضية ، حيث وجدنا أن ضربة قاضية NPR-C أنقذت مستويات التعبير ApoE في كل من HUVSMCs وخلايا العضلات الملساء الشريان التاجي (CASMCs) تتعرض ل CC2238 / α ANP (أرقام 2A و 3 a).

Image

تحفز C2238 / α ANP على إلغاء تنظيم ApoE من خلال الآليات المعتمدة على NPR-C المرتبطة بإعادة تنظيم miR199a و Egr-1 في HUVSMCs. ( أ ) التحليل من قبل RT-PCR والنشاف الغربي لمستويات التعبير ApoE على CC2238 / α ANP في NPR-C الخلايا غير إسكات وإسكات. ** P <0.0001 لـ CC2238 / α ANP مقابل جميع العينات الأخرى. ( ب ) مستويات mR199a-3p ، mR199a-5p ، DNAJA4 mRNA تحت إما TT2238 / α ANP أو CC2238 / α ANP (الجزء العلوي من اللوحة) وفي NPR-C لا يتم إسكات الخلايا وإسكاتها تحت CC2238 / α ANP من لوحة). واستخدمت اثنين من سيرنا محددة للحصول على إسكات الجينات NPR-C. ** P <0.0001 لـ CC2238 / α ANP مقابل TT2238 / α ANP و CTR. < P <0.005 لـ TT2238 / α ANP مقابل نسبة النقر إلى الظهور و CC2238 / α ANP مقابل نسبة النقر إلى الظهور (miR199a-3p و miR199a-5p). ( ج ) النشاف الغربي التمثيلي لـ Egr-1 ، مع تحليل قياس الكثافة المقابل تحت التعرض ANT2238 / α أو CC2238 / α ANP (الجانب الأيسر) وتحت CC2238 / α ANP في خلايا NPR-C غير المسكتة والصامتة (الجانب الأيمن) . ** P <0.0001 لـ CC2238 / α ANP مقابل جميع العينات الأخرى. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​± SD عدد التجارب المستقلة = 6. CC2238 / α ANP ، البديل α ANP ؛ TT2238 / α ANP ، النوع البري α ANP ؛ siRNA1، NPR-C كاتم الجينات 1؛ siRNA2، NPR-C كاتم الجينات 2؛ hsa-miR199a ، microRNA199a البشري ؛ Egr-1 ، استجابة نمو مبكر البروتين -1 ؛ نسبة النقر إلى الظهور ، التحكم

الصورة بالحجم الكامل

Image

تحفز C2238 / α ANP على إلغاء تنظيم ApoE من خلال الآليات المعتمدة على NPR-C المرتبطة بإعادة تنظيم miR199a و Egr-1 في CASMCs. ( أ ) التحليل من قبل RT-PCR والنشاف الغربي لمستويات التعبير ApoE على CC2238 / α ANP في NPR-C الخلايا غير إسكات وإسكات. ** P <0.0001 لـ CC2238 / α ANP مقابل جميع العينات الأخرى. ( ب ) مستويات mR199a-3p ، mR199a-5p ، DNAJA4 mRNA تحت إما TT2238 / α ANP أو CC2238 / α ANP (الجزء العلوي من اللوحة) وفي NPR-C لا يتم إسكات الخلايا وإسكاتها تحت CC2238 / α ANP من لوحة). واستخدمت اثنين من سيرنا محددة للحصول على إسكات الجينات NPR-C. ** P <0.0001 لـ CC2238 / α ANP مقابل TT2238 / α ANP و CTR. < P <0.005 لـ TT2238 / α ANP مقابل نسبة النقر إلى الظهور و CC2238 / α ANP مقابل نسبة النقر إلى الظهور (miR199a-3p و miR199a-5p). ( ج ) النشاف الغربي التمثيلي لـ Egr-1 ، مع تحليل قياس الكثافة المقابل تحت التعرض ANT2238 / α أو CC2238 / α ANP (الجانب الأيسر) وتحت CC2238 / α ANP في خلايا NPR-C غير المسكتة والصامتة (الجانب الأيمن) . ** P <0.0001 لـ CC2238 / α ANP مقابل جميع العينات الأخرى. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​± SD عدد التجارب المستقلة = 6. لمعرفة الاختصارات ، انظر الشكل 2

الصورة بالحجم الكامل

تجدر الإشارة إلى أن الأدلة السابقة أظهرت أن مستويات تعبير ApoE يتم تنظيمها جينيًا بواسطة miR199a-3p و miR199a-5p ، والتي بدورها يمكن أن تستهدف مباشرة ApoE أو تستهدف بروتين الصدمة الحرارية DNAJA4 ، الذي يشجع على تنظيم ApoE. 14 تمشيا مع هذا الدليل ، وجدنا أن مستويات التعبير miR199a-3p و miR199a-5p يتم تنظيمها بشكل كبير بواسطة CC2238 / α ANP ، في حين يتم ضبطها بواسطة TT2238 / α ANP. من ناحية أخرى ، أدى مستوى تعبير DNAJA4 إلى التقليل من تنظيمه بواسطة CC2238 / α ANP ، بينما لم يتغير في الخلايا المعرضة لـ TT2238 / α ANP (الشكلان 2 ب و 3 ب). ومن المثير للاهتمام ، لاحظنا أن ضربة قاضية NPR-C أنقذت miR199a-3p ، و miR199a-5p ومستويات التعبير DNAJA4 في كلا خطوط VSMC تعامل مع CC2238 / α ANP (أرقام 2 ب و 3 ب). تشير هذه البيانات إلى أن NPR-C ينظم مستويات ApoE من خلال تنظيم miR199a-3p و miR199a-5p و DNAJA4.

NPR-C ينظم miR199a من خلال التفعيل المعتمد على ROS لبروتين الاستجابة السريعة للنمو المبكر (Egr-1)

بعد ذلك ، حاولنا توضيح آليات الإشارات التي من خلالها تقوم NPR-C بتعزيز إعادة تنظيم miR199a-3p و miR199a-5p ، وإلغاء التنظيم لـ DNAJA4 ، وفي نهاية المطاف ، إلغاء تنظيم مستويات تعبير ApoE استجابةً ل CC2238 / α ANP. تم العثور على عامل النسخ Egr-1 مسبقًا لتعزيز تنظيم miR199a. 15 بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما يتم تنشيط Egr-1 في الأوعية الدموية أثناء الإجهاد ، وقد تم وصفه بأنه متورط في عملية تصلب الشرايين. 16 لذلك ، قمنا بتقييم ما إذا كان Egr-1 متورطًا في التنظيم المعتمد على NPR-C لـ miR199a-3p و miR199a-5p ردًا على CC2238 / α ANP. وجدنا أن Egr-1 يتم تنظيمه استجابةً إلى CC2238 / α ANP وقد تم إلغاء هذا التأثير بواسطة ضربة قاضية NPR-C (الشكلان 2c و 3 c). من المعروف أن CC2238 / α ANP يحث على تنشيط NADPH أوكسيديز المعتمد على NPR-C وإنتاج ROS. 9 ، 10 Egr-1 يمكن تفعيلها بواسطة ROS. 17 وفقًا لذلك ، وجدنا أن عملية التنظيم غير المعتمدة على C238 / α لـ ANG من Egr-1 قد تم تمييعها بواسطة أبوسينين ، وهو مثبط أوكسيديز NADPH (الشكل التكميلي S1). وأخيرا ، وجدنا أن Egr-1 ضربة قاضية تطبيع مستويات miR199a و DNAJA4 وحظرت تنظيم ApoE في كلا الخطوط VSMC تعامل مع CC2238 / α ANP (الشكل 4). بشكل عام ، تشير هذه البيانات إلى أن CC2238 / α ANP يؤدي إلى إعادة تنظيم miR199a وخفض مستوى ApoE في VSMCs من خلال إنتاج ROS المعتمد على NPR-C والذي يؤدي بدوره إلى تنشيط Egr-1.

Image

تأثير إسكات جين Egr-1 على المسار التنظيمي ApoE في كل من HUVSMCs و CAMSCs. ( أ ) تأثير إسكات الجينات Egr-1 على مستويات Egr-1 و miR199-3p و miR199-5p و DNAJA4 (كما تم الكشف عنها بواسطة RT-PCR) وعلى مستويات تعبير ApoE (كما تم الكشف عنها بواسطة كل من RT-PCR والنشاف الغربي ) في HUVSMCs. واستخدمت اثنين من سيرنا محددة للحصول على اضطراب الجينات Egr-1. ( ب ) تأثير إسكات الجينات Egr-1 على مستويات Egr-1 و miR199-3p و miR199-5p و DNAJA4 (كما تم الكشف عنها بواسطة RT-PCR) وعلى مستويات تعبير ApoE (كما تم الكشف عنها بواسطة RT-PCR و Western لطخة) في CASMCs. يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​عدد التجارب المستقلة = 4 لكل خطوط خلية. ** P <0.0001 لـ CC2238 / α ANP مقابل جميع النقاط الأخرى. siRNA1، Egr-1 gene silencer 1؛ siRNA2، Egr-1 gene silencer 2؛ للاطلاع على الاختصارات الأخرى ، انظر الشكلين 2 و 3

الصورة بالحجم الكامل

CC2238 / α ANP ينظم موت الخلايا المبرمج ، النخر والالتهاب في VSMCs من خلال تنظيم ApoE المعتمد على NPR-C

بعد ذلك ، قمنا بتقييم الأهمية البيولوجية لتطبيق اللامركزية ApoE في الخلايا المعرضة لـ CC2238 / α ANP. تُظهر الأشكال التكميلية S2 و S3 نتائج تحليل النشاف الغربي لتقييم مستويات التعبير عن caspase-3 المشقوق ، والقمع الخلوي للجين المحفز بواسطة E1A (CREG) ، وكلا أشكال JNK المفسرة والإجمالية لـ JNK و p38MAPK في HUVSMCs ) وفي CASMCs (الشكل التكميلي S3) بحضور CC2238 / α ANP. تمت زيادة claved caspase-3 بواسطة CC2238 / α ANP (الأشكال التكميلية S2A و S3A). من ناحية أخرى ، تم تقليل التعبير عن CREG ، وهو عامل مضاد للخلايا (الأشكال التكميلية S2B و S3B). تمشيا مع الدراسات السابقة التي أظهرت أن CREG يحول دون موت الخلايا المبرمج VSMC من خلال تثبيط مسارات إشارات p38MAPK و JNK ، 18 لاحظنا زيادة فسفورية موازية لكل من p38MAPK و JNK في كل من HUVSMCs و CASMCs المعالجين بـ CC2238 / α ANP بالمقارنة مع خلايا التحكم الأرقام S2C ، D ، S3C و D). تجدر الإشارة إلى أن ضربة قاضية NPR-C أنقذت تمامًا تأثيرات CC2238 / α ANP على المشقوق-كاسباس 3 ، الفسفو- p38MAPK ، phosphoJNK و CREG. كما زادت المستويات الخلوية لل NF- κ B و Smad4 ، وهي علامات معروفة للالتهابات ، بشكل كبير في كل من HUVSMCs و CASMCs المعرضين إلى CC2238 / α ANP (الأرقام التكميلية S2E و F و S3E و F). قلل من إسكات الجينات NPR-C زيادة كل من NF- κ و Smad4 على الرغم من وجود CC2238 / α ANP في كلا خطوط VSMC (الأرقام التكميلية S2E و F و S3E و F). إجمالاً ، تشير هذه النتائج إلى أن C2238 / α ANP يستحث موت الخلايا المبرمج والتهاب في VSMCs من خلال آليات تعتمد على NPR-C.

تجدر الإشارة إلى أننا وجدنا أن هذه الآليات تتم بوساطة نظام ApoE. بادئ ذي بدء ، كشف تحليل التسلسل أن HUVSMCs تعبر عن أشكال الإسقاط ApoE 2 و 3 (APOE2 / APOE3) في حين أن CASMCs تعبر عن أشكال الإسقاط ApoE 3 و 4 (APOE3 / APOE4) (الشكل التكميلي 4). الأهم من ذلك ، وجدنا أن استعادة مستويات ApoE في كل من HUVSMCs (الشكل 5 أ) و CASMCs (الشكل 5 ب) تعامل مع CC2238 / α ANP من خلال الإدارة الخارجية المصاحبة لإيزومورم ApoE المؤتلف المقابل كانت قادرة على إنقاذ حيوية الخلية ، والتي كانت كبيرة ضعيف بواسطة CC2238 / α ANP وحده مقارنة بالخلايا غير المعالجة. قللت إدارة ApoE بشكل كبير من موت الخلايا المبرمج في وقت مبكر ومتأخر والنخر الناتج عن CC2238 / α ANP. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر VSMCs انخفاضًا ملحوظًا في الالتهاب تحت التعرض لـ ApoE المؤتلف على الرغم من وجود CC2238 / α ANP (الشكل 6).

Image

تأثير مؤتلف ApoE على بقاء الخلية في وجود CC2238 / α ANP في كل من HUVSMCs ( أ ) وفي CASMCs ( ب ) تعرضت الخلايا إلى مؤتلف ApoE و CC2238 / α ANP. في نهاية التحفيز ، تم تحليل جدوى الخلية بواسطة FACS. تُظهر كل لوحة شخصية مؤامرات مبعثر تمثيلية لكل حالة تجريبية (الجانب الأيسر) وتحليل قياس الكثافة المقابل (الجانب الأيمن). يتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط ​​عدد التجارب المستقلة = 3 لكل شكل من أشكال الإسقاط ApoE. ** P <0.0001 لـ CC2238 / α ANP مقابل جميع النقاط الأخرى. CC2238 / α ANP ، البديل α ANP ؛ نسبة النقر إلى الظهور ، التحكم ؛ PI ، بروبيديوم يوديد ؛ ApoE ، أبولي بروتين E ؛ نسبة النقر إلى الظهور ، التحكم

الصورة بالحجم الكامل

Image

تأثير مؤيد ApoE على علامات الالتهاب في وجود CC2238 / α ANP في كل من HUVSMCs ( أ ) و CASMCs ( ب ). تعرضت الخلايا بالتزامن إلى ApoE المؤتلف و CC2238 / α ANP. بعد أربع وعشرين ساعة من الانتهاء من التحفيز ، تم تحليل البروتينات الكلية لعلامات الالتهاب بواسطة لطخة غربية. ( أ ) لطخة غربية تمثيلية لـ Nf- and و Smad4 ، مع تحليل قياس الكثافة المقابل ، في HUVSMCs. ( ب ) لطخة غربية تمثيلية من Nf- κ و Smad4 ، مع تحليل قياس الكثافة المقابل ، في CASMCs. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​± SD عدد التجارب المستقلة = 3 لكل شكل إسوي ApoE. ** P <0.0001 لـ CC2238 / α ANP مقابل جميع النقاط الأخرى. CC2238 / α ANP ، البديل α ANP ؛ ApoE ، أبولي بروتين E ؛ نسبة النقر إلى الظهور ، التحكم

الصورة بالحجم الكامل

نقاش

يعد متغير الجينات T2238C / α ANP أحد عوامل الخطر القلبية الوعائية غير القابلة للتعديل. في الواقع ، الأشخاص الذين يحملون هذا المتغير الوراثي يكونون أكثر عرضة لحدوث أحداث ضارة في القلب والأوعية الدموية ، مثل السكتة الدماغية واحتشاء عضلة القلب. بالإضافة إلى ذلك ، تعرض هذه المواضيع علامات ضعف البطانة بالفعل في سن مبكرة. هنا ، قمنا بتحليل تأثير متغير الجينات T2238C / α ANP على الآليات المتعلقة بتصلب الشرايين. وجدنا أن C2238 / α ANP ينقص بشكل كبير التعبير الجيني لـ ApoE في VSMCs من خلال آليات تعتمد على NPR-C. لقد أثبتنا أيضًا أن C2238 / α ANP يلعب هذا التأثير من خلال التنظيم اللاجيني الانتقائي لـ ApoE الذي يتضمن Egr-1 واثنين من RNAs غير المشفر الصغير (miR199a-3p و miR199a-5p). الأهم من ذلك ، قدمنا ​​أدلة على أن الآثار الضارة الناجمة عن C2238 / α ANP-NPR-C محور في VSMCs ، مثل زيادة معدل موت الخلايا المبرمج ، نخر والالتهابات ، يمكن استردادها بالكامل عن طريق مكملات البروتين ApoE المؤتلف (الشكل 7).

Image

تمثيل تخطيطي للمسار الذي يشمل NPR-C و Egr-1 و miR199a-3p و miR199a-5p على تعديل ApoE عند تعرض CC2238 / α ANP في VSMCs. تدعم الآثار الإيجابية لمكملات ApoE لـ VSMCs ، على الرغم من تعرض CC2238 / α ANP ، المساهمة القوية لهذا المسار في تعزيز تلف الأوعية الدموية من خلال التنظيم النهائي لنظام ApoE. C2238 / α ANP ، البديل α ANP ؛ NPR-C ، نوع C مستقبلات الببتيد الناتريوتريك. روس ، وأنواع الأكسجين التفاعلية ؛ Egr-1 ، استجابة نمو مبكر البروتين -1 ؛ mi199a، microRNA199a؛ CREG ، القامع الخلوي للجين المحفز بواسطة E1A ؛ JNK ، c-Jun N-terminal kinase

الصورة بالحجم الكامل

هذه البيانات تمتد إلى حد كبير أدلةنا السابقة التي تبين أن C2238 / α ANP يستحث موت الخلايا البطانية والإجهاد التأكسدي ، ويقلل من الأوعية الدموية ويعزز الخلل الوظيفي البطانية من خلال تنشيط إلغاء تنشيط إشارات NPR-C / cAMP والحد من PKA / Akt / eNOS المسار. 9 ، 10 بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا مؤخرًا أن C2238 / α ANP يزيد الضغط التأكسدي والهجرة الخلوية ويعزز تضيق الأوعية من خلال مسار الإشارة NPR-C / cAMP / PKA / CREB / miR21. 11 توضح الدراسة الحالية لأول مرة تأثيرًا مباشرًا لـ C2238 / α ANP على الآليات الكامنة وراء تصلب الشرايين في VSMCs ، وهو عنصر رئيسي في هذه العملية. في الواقع ، يستحث C2238 / α ANP عملية تخفيض تنظيمية كبيرة لـ ApoE والتي تلعب دورًا مهمًا في تطور تصلب الشرايين. 19 ، 20 ApoE هو بروتين 34 كيلو دالتون يشارك في تعبئة وتوزيع الكوليسترول والدهون الأخرى بين أنسجة الجسم المختلفة. 20 ومن المعروف أن نقص ApoE وحده يشجع على تطوير لويحات تصلب الشرايين الأبهري في الفئران. أثبتت الدراسات السابقة أن ApoE تمارس أيضًا التأثيرات الخلوية المضادة للالتهاب القلبية ومضادة للالتهابات. تم العثور على ApoE سابقًا للتعبير عنه في VSMCs حيث يرتبط تقليل تنظيم ApoE بشكل إيجابي بالعلامات النموذجية للالتهابات مثل Smad4 22 و NF- κ 23. بالإضافة إلى ذلك ، يعوق ApoE الوظائف المسببة للالتهابات للخلايا الالتهابية. 24 عند البشر ، حيث يكون قلة ApoE أمرًا نادرًا ، يرتبط خطر تصلب الشرايين ارتباطًا وثيقًا بثلاثة أشكال إسفنجية مشتركة apoE بترتيب APOE4> APOE3> APOE2. 20 علاوة على ذلك ، من المعروف أن ApoE تلعب دورًا في تطور كل من أمراض القلب والأوعية الدموية 25 والأمراض العصبية. 26 لذلك ، قد توحي دراستنا أن C2238 / α ANP يستحث التشوهات الخلوية من خلال تثبيط المؤثرات الجانبية متعددة الجوانب الموصوفة أعلاه من ApoE. علاوة على ذلك ، نظرًا لأن مستويات المايلوبوكسيداز الأعلى تم الإبلاغ عنها في الفئران Apo - / - 27 ، يمكننا أن نفترض أن C2238 / α ANP قد يرتبط ، جزئيًا على الأقل ، بمستويات المايلوبوكسيداز الأعلى ، كما ورد سابقًا في مرضى الشريان التاجي ، 4 من خلال قدرته لخفض ApoE التعبير الجيني.

من ناحية أخرى ، تشير نتائجنا الحالية إلى أن النوع البري من α ANP قد يمارس تأثيرات فسيولوجية مضادة للتجلط عن طريق تنظيم مستويات ApoE. ويدعم هذا الاحتمال من قبل الأدلة السابقة التي تشير إلى وجود علاقة وثيقة بين الببتيدات الناتريوتريك (NPs) وتصلب الشرايين. في الواقع ، يتم التعبير عن NPs بشكل ملحوظ في الاكتشافات التاجية البشرية للآفات تصلب الشرايين المتقدمة. 28 منع تثبيط NP بواسطة كانوكاتريل المانع NEP منعت الودائع الدهنية في نموذج أرنب. 29 تتزايد مستويات NP الدائرية بالتوازي مع زيادة تضيق البلاك التاجي ، حيث تصل إلى مستوى الهضبة عند أعلى درجة من تضيق الوعاء. 30

والجدير بالذكر أن العمل السابق قد أظهر أن تصلب الشرايين يزيد في نموذج حيواني يفتقر إلى كل من NPR-A و ApoE (Npr1 - / - ApoE - / - الفئران) ، 31 مما يشير إلى أن نقص NPR-A يمكن أن يحفز نمو VSMC من خلال إشارات مستقبلات أخرى ، وبالتالي تعزيز الآثار الوعائية السلبية بسبب نقص ApoE.

النتيجة الأصلية الأخرى لدراستنا هي التوضيح بأن C2238 / α ANP يستحث تنظيم ApoE من خلال تنظيم Egr-1 المعتمد على NPR-C. يتوسط هذا التأثير نشاط NADPH أوكسيديز ، لأن أبوسينين ألغى تأثيرات C2238 / α ANP على تنشيط Egr-1. على حد علمنا ، هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تنظيم تنظيم جيني سلبي لـ ApoE بواسطة Egr-1 في سياق الأوعية الدموية. يمتد هذا الاستنتاج أيضًا إلى الأدلة السابقة التي تدعم دور تنشيط Egr-1 في تطور تصلب الشرايين وقد تشير إلى أن تنشيط Egr-1 قد يساهم في تصلب الشرايين من خلال تنظيم ApoE. ومن المثير للاهتمام ، أن العمل السابق قد أظهر أن تصلب الشرايين يتم تقليله في نموذج خروج المغلوب من الفئران Egr-1 و ApoE ، مقارنةً بالملاحظة في نموذج خروج المغلوب ApoE - / - فقط ، مما يوحي بأن نقص Egr-1 هو واقي في غياب من ApoE. 32 دراستنا تمتد هذه الأدلة من خلال إظهار أن Egr-1 يمكن أن يكون المنبع من ApoE ، ينظم سلبا التعبير.

تجدر الإشارة إلى أن تنشيط Egr-1 بواسطة C2238 / α ANP يشجع إعادة تنظيم miR199a-3p و miR199a-5p ، مما يؤكد النتائج السابقة التي توضح أن Egr-1 ينظم miR199a. 15 تشير هذه البيانات إلى أن Egr-1 قد ينظم ApoE جينيًا من خلال هاتين الرنايتين المجهرتين (miRNAs). في الواقع ، Pencheva وآخرون. أظهر 14 مؤخرًا أن miR199a-3p و miR199a-5p ينظمان تكوين ورم الميلانوما من خلال تقليل مستويات ApoE. وجد الباحثون أن هذه miRNAs قد تستهدف إما ApoE بشكل مباشر أو غير مباشر مستويات ApoE من خلال استهداف DNAJA4 ، وهو بروتين صدمة حرارية يحفز مستويات ApoE. تمشيا مع هذا الدليل ، وجدنا أيضا أن الإشارة C2238 / α ANP / NPR-C / Egr-1 / miR199a تعزز تنظيم مستويات DNAJA4.

تجدر الإشارة إلى أن هذه النتائج تعزز الأدلة المتاحة التي توضح دور miRNAs في التسبب في تشوهات VSMC وأمراض الأوعية الدموية بشكل عام. في هذا الصدد ، وجدنا من قبل أن خلل التنظيم في miR21 ساهم في حدوث اختلالات VSMC عند تحفيز C2238 / α ANP. 11 بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور مؤخراً على تقليل تنظيم miR23b في جدار الأوعية الدموية المصابة لتعديل التبديل الظاهري VSMC من خلال إشراك كل من SMAD3 و FOXO4. 33 بشكل عام ، يدعم هذا الدليل معرفة أن الآليات الجينية المعتمدة على ميرنا يمكنها تنظيم التسبب في الأمراض البشرية بطريقة تكاملية للغاية.

عمليات التسليم السابقة من ApoE3 البشري عن طريق الحقن البلازميدي العضلي والفيروسات الغدية ، 34 بواسطة الببتيدات الاصطناعية المحاكية للبولي بروتينات 35 أو عن طريق منصة قائمة على الخلايا ، 36 تمنع تطور الآفات تصلب الشرايين. قمنا في البداية بتقييم الإسقاط ApoE المحدد المعبر عنه بخطوط VSMC المستخدمة في دراساتنا ، والتي لم يتم الإبلاغ عنها من قبل. وبالتالي ، لاحظنا الفوائد الكاملة من تعرض VSMCs لإيزوفورم ApoE المؤتلف ، على الرغم من وجود C2238 / α ANP. يمكن أن تفسر التأثيرات متعددة التأثيرات الناتجة عن ApoE نتائجنا جيدًا ، حيث أن هذا البروتين غير قابل للحمل ليس فقط من خلال تأثيره على تقليل الدهون ولكن أيضًا من خلال الأنشطة المضادة للأكسدة والمضادة للالتهابات. 19 تسليط الضوء على النتائج المفيدة التي تم الحصول عليها من خلال العلاج ApoE من VSMCs التالفة المعرضة ل C2238 / α ANP الدور الرئيسي المحتمل لهذا الجزيء في علاج تصلب الشرايين في الأشخاص الذين يعانون من البديل C2238 / α ANP ، على الرغم من وجود العديد من القيود لتطبيقه السريري.

باختصار ، أبلغنا عن أول دليل على وجود آلية جديدة للأمراض الوعائية في VSMCs بوساطة NPR-C ، والتي تتضمن Egr-1 واثنين من الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر ، مما يؤدي في النهاية إلى إلغاء تنظيم ApoE ، في وجود متغير الجين C2238 / α ANP ، عامل خطر القلب والأوعية الدموية الناشئة. يسهم تسلسل التحويل المكتشف حديثًا في مجموعة واسعة من الإجراءات الوعائية الضارة بسبب C2238 / α ANP والتي تتناقض مع الخصائص المفيدة المعروفة للنوع البري α ANP. علاوة على ذلك ، فإن اكتشافاتنا الحديثة تكتشف تصرفات مؤلمة متعددة الأشكال من NPR-C في خلايا الأوعية الدموية من خلال مشاركتها في التنظيم اللاجيني للبروتينات المضادة للتجلط الدموي الوعائي ، مثل البروتين البروتيني الشحمي.

المواد والأساليب

تحفيز HUVSMCs مع TT2238 و CC2238 / α ANP واستخراج الحمض النووي الريبي لتحليل تصلب الشرايين الماكرو

تم تحفيز HUVSMCs المتاحة تجاريا إما من النوع البري الصناعي (TT2238) أو متحولة (CC2238) / α ANP بتركيز نهائي قدره 10 9 مول / لتر لمدة 12 ساعة ، كما هو موضح سابقًا. تلقى 9 ، 10 ، 11 لوحات التحكم α المتوسطة خالية من ANP. أجريت ثلاث تجارب. تم استخدام الحمض النووي الريبي الكلي ، التي تم الحصول عليها في نهاية التحفيز ، لتوليف [كدنا] ثم لتحليل macarray. تم الحصول على تأكيد الجين ApoE وتعديل البروتين على CC2238 / α ANP و TT2238 / α ANP لاحقًا في تجارب مستقلة في HUVSMCs وأيضًا في CASMCs (عدد التجارب = 6 لكل خط خلية) بواسطة RT-PCR ، استنادًا إلى منهجية SYBR Green ، ومن خلال النشاف الغربي للبروتينات الكلية.

تأثير إسكات الجينات NPR-C على تعديل جين ApoE والبروتين على CC2238 / α ANP

تم تكرار تحفيز HUVSMCs و CASMCs باستخدام CC2238 / α ANP سواء في وجود أو في غياب NPR-C (عدد التجارب = 6) للتحقق من دور هذا المستقبل في التوسط في آثار CC2238 / α ANP على جين ApoE و مستويات التعبير البروتين ، وفقا لتقاريرنا السابقة. 10 ، 11

دور التنشيط المعتمد على NPR-C لـ miRNA199a-3p و miRNA199a-5p في تعديل ApoE بواسطة CC2238 / α ANP. تورط Egr-1

للتحقق مما إذا كان هناك تعديل جيني معروف لـ ApoE ، يعتمد على miRNA199a-3p و 199a-5p ، 14 لعب دورًا في سياقنا التجريبي ، RNA الكلي ، المستخلص من كل من NPR-C لم يتم إسكاته وإسكاته HUVSMCs و CASMCs ، تم تنقيته لعزله الحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام مجموعة المتاحة تجاريا. ل RT-PCR من DNAJA4 ، وهو هدف معروف من miRNA199a ، 14 تم استخدام مقايسة التعبير الجيني TaqMan. بعد ذلك ، استنادًا إلى المعرفة السابقة بأن مستويات التعبير miRNA199a يتم تعديلها بواسطة Egr-1 ، 15 قمنا بتقييم مستوى تعبير البروتين Egr-1 إما على TT2238 / α ANP أو CC2238 / α ANP بواسطة النشاف الغربي. كما أنشأنا بشكل أفضل دور Egr-1 في تعديل ApoE تحت CC2238 / α ANP مع تجارب إضافية. أولاً ، تم التحقق من الدور المعروف للإجهاد التأكسدي على تحفيز Egr-1 17 من خلال تعريض VSMCs إلى CC2238 / α ANP في غياب ووجود apocynin (عدد التجارب = 3) ، وفقًا للشروط الموصوفة مسبقًا. لذلك تم تقييم 9 مستويات التعبير Egr-1 بواسطة النشاف الغربي. بعد ذلك ، تم تحديد تشكيل كل من miRNA199a-3p و miRNA199a-5p ، من DNAJA4 و ApoE في ESG-1 إسكات VSMCs المعرضة لـ CC2238 / α ANP (عدد التجارب = 4).

تقييم مستويات التعبير كاسباس 3 ، CREG ، JNK ، p38MAPK ، Nf- ك Bp65 و TGF β (Smad4) مستويات التعبير كعلامات على موت الخلايا المبرمج ، نخر والالتهابات على CC2238 / α ANP سواء في وجود وفي غياب NPR-C

للتحقق مما إذا كان التنظيم الناجم عن تعبير ApoE في ظروفنا التجريبية مرتبطًا ، كما هو متوقع ، بزيادة معدل موت الخلايا المبرمج ، والنخر والالتهاب ، تم تحليل 13 بروتينًا إجماليًا باستخدام الأجسام المضادة الأولية المحددة التالية: كابساس 3 المضادة للجسم ، ومكافحة الفسفوجنك ، ومكافحة JNK ، ومكافحة الفوسفو ، p38MAPK ، ومكافحة p38MAPK ، ومكافحة NF κ Bp65 ، ومكافحة Smad4 ، ومكافحة actاكتين. هذا الأخير كان يستخدم البروتين التدبير المنزلي. بعد الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي الفيروكسيديز مترافق ، تم الكشف عن إشارات كما هو موضح أدناه.

تأثير التعرض لـ Apo المؤتلف على قابلية الخلية للخلايا ، موت الخلايا المبرمج ، النخر والالتهاب في كل من HUVSMCs و CASMCs في وجود CC2238 / α ANP

لاختبار قدرة مكملات ApoE على إنقاذ الآثار الضارة الناجمة عن CC2238 / α ANP ، واستناداً إلى نتائج متسلسلة من أشكال الإسقاط ApoE المحددة المعبر عنها في خطي الخلايا ، تم تعريض HUVSMCs لمدة 12 ساعة إلى CC2238 / α ANP وأي من المؤتلف المؤيد أو بروتين ApoE3 (10 ميكروغرام / مل ؛ سيجما). تعرضت CAMSCs إلى CC2238 / α ANP وإما البروتين ApoE3 أو ApoE4 المؤتلف (10 ميكروغرام / مل ؛ سيغما). تمت إضافة البروتينات المؤتلفة لـ ApoE إلى VSMCs كما هو موضح سابقًا. 37

بعد أربع وعشرين ساعة من الانتهاء من التعرض لـ CC2238 / α ANP والخاصية المعيارية ApoE المؤتلفة ، تم إجراء عدد الخلايا المبرمج من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي (FACS) وتم استخراج البروتينات الكلية لتحليل النشاف الغربي لـ Nf- p Bp65 و Smad4.

وأجريت التجارب في ثلاث نسخ لكل إسوف ApoE.

ثقافة الخلايا

HUVSMCs المتاحة تجارياً ، التي تم شراؤها من ATCC (American Culture Culture Collection ؛ Manassas ، VA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، تم زراعتها في وسط F12 من Kaighn يحتوي على ملي ملي مولوجرام من الجلوتامين و 1.5 جم / لتر من بيكربونات الصوديوم ومكمل بـ 0.1 ملغ / مل من الهيبارين ، 0.03 ملغ / مل تكملة نمو الخلايا البطانية ، 10 ٪ مصل الأبقار الجنين. نمت CASMCs المتاحة تجاريا (تم شراؤها من Lonza ، Walkersville ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية) في Smooth Muscle Growth Medium-2 (SmgM-2 ؛ Lonza). تم استخدام أربع دفعات لكل خط خلية لإجراء جميع التجارب.

واستخدمت الخلايا داخل الممر الخامس وعند التقاء 70 ٪. للتحفيز باستخدام TT2238 أو CC2238 / α ANP ، تم زرعها في 24 لوحة (8 × 10 4 خلايا / بئر) ، تم تربيتها في وسط نمو كل منها لمدة 24 ساعة ، وتم تجويعها وتحفيزها لاحقًا مع α ANP بتركيز نهائي من 10 9 مول / لتر لمدة 12 ساعة في وجود مصل العجل الجنين 10 ٪. تلقى لوحات التحكم α المتوسطة خالية من ANP.

مجموع استخراج الحمض النووي الريبي

تم الحصول على إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام كاشف Trizol (Life Technologies ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، خضع لعلاج DNAse I (Qiagen ، Venlo ، هولندا) وتم تنقيته لاحقًا باستخدام RNeasy Mini Kit (Qiagen) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي عن طريق تغيير طبيعة الاغاروز الكهربائي للهلام وتم التحقق من تركيزه باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية NanoDrop2000c (Thermo Scientific، Waltham، MA USA).

RT-PCR تحليل macarray

أجريت ثلاث تجارب مع كل من التحفيز وتم تجميع الحمض النووي الريبي لتحليل macarray. واستخدمت اثنين ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع لتوليف [كدنا] باستخدام RT 2 الأولى ستراند كيت (Qiagen). أجرينا تحليل الكمي RT-PCR الكمي باستخدام الإنسان تصلب الشرايين RT 2 Profiler PCR Array تم شراؤها من Qiagen. تم إجراء التجارب كما هو موضح سابقًا. 9 باختصار ، تم خلط قالب [كدنا] مع واحد من جاهز لاستخدام RT 2 في الوقت الحقيقي SYBR الأخضر PCR ماستر ميكس (Qiagen). تحتوي المجموعة المختارة على لوحة مكونة من 84 مجموعة تمهيدية للجينات التي تركز على المسار (تصلب الشرايين البشري) وخمس جينات للتدبير المنزلي وثلاثة عناصر تحكم في جودة RNA و PCR. تم اختزال الخليط في كل بئر من نفس الصفيحة التي تحتوي على مجموعات أولية من الجينات المحددة مسبقًا وتم تنفيذ PCR على نظام PCR بنظام ViiA 7 Real-Time (تقنيات الحياة). وأجريت التجارب في ثلاث نسخ. تم إجراء تحليل البيانات باستخدام بوابة تحليل بيانات PCR Array (http://www.superarray.-com/pcrarraydataanalysis.php) وطريقة ΔΔCt. 38 تم التعبير عن النتائج كمستويات نسبية لكل رنا جيني تحت تأثير CC2238 أو TT2238 / α يشير ANP إلى تعبير هذا الجين في خلايا غير محفزة (تم اختيارها لتمثيل تعبير 1x لكل جين). واعتبرت النتائج كبيرة عندما كان التعبير مرنا 5 أضعاف أو أقل من تلك الخلايا غير المحفز.

RT-PCR الكمي لـ ApoE ، NPR-C ، Egr-1 (منهجية SYBR الخضراء)

تم خلط اثنين من ميكرولتر من [كدنا] مع 5 ميكرولتر من SYBR Green PCR master Mix (Life Technologies) و 0.5 ميكرولتر من أجهزة الاشعال المحددة: ApoE (الأمام 5′-GAGCAAGCGGTGGAGACAG-3 ′ والخلف 5′-CATCAGCGCCCTCAGTTCC-3) ؛ NPR-C (الأمام 5′-GGAAGACATCGTGCGCACA-3 'والعكس 5'-GATGCTCCGGATGGTGTCA-3 ') ؛ Egr-1 (الأمام 5′-ACCGCAGAGTCTTTTCCTGACA-3 ′ والخلف 5′-GGTGCAGGCTCCAGGGAAAA-3 ′).

تم استخدام ct -Actin كجينات التدبير المنزلي (الأمام 5′-GCAAGAGATGGCCACGGCTG-3 ′ والخلف 5′-CCACAGGACTCCATGCCCAG-3 ′). تم تنفيذ RT-PCR على نظام PCR في الوقت الحقيقي ViiA 7 مع ظروف تدوير 50 ​​درجة مئوية لمدة دقيقتين ، 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ليصبح المجموع من 40 دورة. أجريت قياسات في ثلاث نسخ في كل اختبار. تم التعبير عن النتائج كمستويات نسبية لكل مرنا جيني مقارنة بخلايا التحكم.

RT-PCR الكمي لـ miRNA199a-3p ، miRNA199a-5p ، DNAJA4 (منهجية TaqMan)

تم تنقية Total RNA لعزل الحمض النووي الريبي الصغير باستخدام مجموعة معينة (miRNeasy Mini Kit ؛ Qiagen) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة. لتوليف [كدنا] من miR199a-3p ، miR199a-5p والتحكم miRU87 ، تم خلط 1 غرام من الحمض النووي الريبي المنقى مع 3 ميكروليتر من NCode VILO miRNA Synthesis Kit (تقنيات الحياة) و 1 × RT-primer (تقنيات الحياة) في حجم رد الفعل الكلي من 20 ميكرولتر . تم تحضين التفاعل عند 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في C-Cler الحرارية T-100 (Bio-Rad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد ذلك ، تمت إضافة 2 ميكروليتر من تفاعل RT إلى 1 ميكرولتر من اختبار TaqMan MicroRNA معين 20 × (miR199a-3p ، miR199a-5p ، miRU87 ؛ Life Technologies) و 10 ميكرولتر من TaqMan Universal PCR Master Mix II مع UNG (تقنيات الحياة) في المجلد النهائي 20 ميكرولتر . تم إجراء RT-PCR باستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي ViiA 7 مع ظروف تدوير تبلغ 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية لما مجموعه 40 دورة. تم تشغيل كل اختبار TaqMan في ثلاث نسخ. تم التعبير عن النتائج كمستويات نسبية لكل ميرنا تحت تأثير علاجات مختلفة بالنسبة للخلايا غير المنشطة.

بالنسبة إلى RT-PCR لـ DNAJA4 ، تم خلط 2 ميكرولتر من [كدنا] مع 10 ميكرولتر من TaqMan Universal Master Mix II مع UNG و 1 ميكرولتر من DNAJA4 TaqMan Gene Expression Assay (تقنيات الحياة) في المجلد النهائي 20 ميكرولتر. ct -آكتين تم استخدامه كجينات التدبير المنزلي. تم إجراء RT-PCR باستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي ViiA 7 مع ظروف تدوير تبلغ 50 درجة مئوية لمدة دقيقتين و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق يليها 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ليصبح المجموع 40 دورات. تم تشغيل كل اختبار في ثلاث نسخ. تم التعبير عن النتائج بمستويات مرنا تحت تأثير العلاجات المختلفة بالنسبة للخلايا الغير محفزة.

مجموع استخراج البروتينات والنشاف الغربي

تم استخراج مجموع البروتينات من الخلايا 24 ساعة بعد الانتهاء من التعرض إما TT2238 / α ANP أو CC2238 / α ANP. تم تذويب العينات في 1: 10 من الوزن / الحجم في محلل تحلل (50 ملي كلوريد الصوديوم ، 100 مل من Tris-HCl pH 7.4 ، 1 مم من حامض إيثيلينيدي أمينيترايتيك (EDTA) ، 1 ٪ SDS) مع إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز (Sigma Aldrich ، Saint Louis ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، حضنت على الجليد لمدة 15 دقيقة. وطردها في 13 000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. تم تحديد تركيز البروتين بواسطة مجموعة الفحص DC Protein Assay (Bio-Rad) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تم غلي محلول البروتين عند درجة حرارة 95 مئوية لمدة 5 دقائق في وجود محلول تحميل جل (Bio-Rad). تم تحميل 50 ميكروغرام من كل عينة على هلام بولي أكريلاميد SDS 10 ٪ وتشغيل لمدة 120 دقيقة في 100 V. ثم تم نقل البروتينات على أغشية البولي فينيلايدين ديفلورايد (PVDF ؛ بيو راد) باستخدام نظام نقل توربو ترانس (بيو راد) ). تم حظر مواقع الربط غير المحددة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الزلال المصل البقري بنسبة 5 ٪ في المخزن المؤقت الملحي تريس مع 0.1 ٪ Tween 20 (سيغما) (TBS-T). Membranes were incubated at 4 °C overnight with the following primary antibodies:

anti-ApoE (1 : 1000; Millipore, Temecula, CA, USA), anti-Egr-1 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-phosphoJNK (1 : 200; Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, USA), anti-JNK (1 : 200; Santa Cruz), anti-phospho-p38MAPK (1 : 200; Santa Cruz), anti-p38MAPK (1 : 200; Santa Cruz), anti-NF κ Bp65 (1 : 200; Santa Cruz), anti-cleaved caspase-3 (1 : 1000; Cell Signaling), anti-Smad4 (1:1000; Cell Signaling); anti-CREG (1:1000; R&D System, Minneapolis, MN, USA), anti- β -actin (1 : 1000; Santa Cruz).

Following three washes of 10 min in TBS-T, membranes were incubated for 1 h at room temperature with 1 : 5000 horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-goat (for ApoE) or goat anti-mouse or goat anti-rabbit secondary antibodies diluted in TBS-T. After three washes of 10 min in TBS-T, signals were revealed with an enhanced chemiluminescence detection system (Luminata Crescendo; Millipore, Darmstadt, Germany) and the immunoreactivity of bands was visualized using ChemiDoc XRS+Imaging System (Bio-Rad). Protein bands were scanned and quantified densitometrically. They were finally normalized using β-actin levels.

NPR-C and Egr-1 gene silencing

NPR-C and Egr-1 gene silencing was performed with specific siRNAs (Mission siRNA; Sigma) by following conditions previously described. 10, 11 Twenty-four hours after transfection, both silenced and not silenced cells were exposed to CC2238/ α ANP for 12 h and subsequently extracted for total RNA and total proteins. Efficiency of gene silencing was assessed by RT-PCR, following conditions described above.

Role of oxidative stress in the Egr-1 induced increase by CC2238/ α ANP

The known role of oxidative stress on Egr-1 stimulation 17 was verified by exposing VSMCs to CC2238/ α ANP both in the absence and in the presence of apocynin, following conditions previously described. 9 Egr-1 expression levels were therefore assessed by western blotting.

Sequencing of apoE gene expressed in HUVSMCs and CASMCs

Genomic DNA was isolated from both HUVSMCs and CASMCs using a commercially available kit (Qiagen, Chicago, IL, USA). In order to identify the three allelic forms of human ApoE gene (allele ɛ2, ɛ3, ɛ4) PCR reactions were set up by using a specific pair of primers: forward 5′-CTCCCACTGTGCGACACC-3′, reverse 5′-CTGCTCCTTCACCTCGTCC-3′. DNA was first amplified by PCR with 40 cycles at an annealing temperature of 55 °C using a T-100 Thermal Cycler (Bio-Rad). Following purification of the PCR product (562 bp) with MinElute PCR purification kit (Qiagen), sequence reactions were prepared using the Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Unincorporated dye terminators from sequencing reactions were removed using DyeEx 2.0 Spin kit (Qiagen). Purified fragments were electrophoresed on an ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) according to the manufacturer's protocol. All sequencing results were compared with those present in the NCBI databases using BLAST to confirm the allelic variants.

Flow-cytometry analysis

Twenty-four hours after completion of exposure to CC2238/ α ANP and the specific recombinant ApoE isoform, counting of apoptotic cells was performed by FACS using Annexin V-Fitc and propidium iodide (PI) staining (ImmunoStep, Salamanca, Spain). For this purpose, cells were harvested by incubation with 1 ml of trypsin/EDTA (Lonza) for 3 min at 37 °C. Trypsinization was stopped by addition of medium and the suspension was centrifuged at 1200 rpm for 5 min at 4 °C. Each pellet was washed with cold phosphate-buffered saline (PBS 1 × ). Then, tubes were vortexed thoroughly and centrifuged again as before. Cells were gently resuspended and vortexed in binding buffer at a concentration of 3 × 10 6 cells/ml. Then, 100 μ l of cell suspension was added to 5 μ l of Annexin V and 10 μ l of PI. Samples were mixed for 15 min in the dark at 4 °C and 400 μ l of PBS 1x was added to the solution. Ten thousand cells were analyzed by FACS on a BD Accuri C6 flow cytometer (Biosciences, Erembodegem-Dorp, Belgium) to count apoptotic cells. Both negative control (untreated cells) and positive control (cells treated with hydrogen peroxide) were included in the analysis.

تحليل احصائي

Continuous variables are expressed as mean±SD Comparisons between two groups were performed using Student's t- test. When the analysis was adjusted for the multiplicity of compared groups, one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test was performed. Normality of variables distribution was tested by the Kolmogorov–Smirnov test. GraphPad Software (San Diego, CA, USA; version 5.0) and SPSS statistical software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA; version 12.0) were used for statistical analysis. اعتبر P <0.05 كبير.

معلومات تكميلية

ملفات PDF

  1. 1.

    معلومات تكميلية

المعجم

Akt

protein kinase B

ApoE

apolipoprotein E

ANP

atrial natriuretic peptide

TT2238/ α ANP

wild-type atrial natriuretic peptide at pos. 2238

CC2238/ α ANP

mutant atrial natriuretic peptide at pos. 2238

معسكر

أدينوسين أحادي الفوسفات

CREG

cellular repressor of E1A-stimulated gene

CREB

cAMP responsive element binding protein

DNAJA4

DnaJ (Hsp40) homolog

Egr-1

early growth response protein-1

أنوش

سينسيز أكسيد النتريك البطانية

EDTA

ethylenediaminetetracetic acid

FOXO4

forkhead box O4

FACS

تحليل التدفق الخلوي

JNK

ج-يونيو N- محطة كيناز

ميرنا

الرنا الميكروي

NADPH

نيكوتيناميد آدينين دينوكليوتيد فوسفات أوكسيديز

Nf- κB

nuclear factor kappa-light chain-enhancer of activated B cells

NPR-C

type C natriuretic peptide receptor

NPR-A

type A natriuretic peptide receptor

PKA

بروتين كيناز أ

ROS

أنواع الاكسجين التفاعلية

RT-PCR

real time-polymerase chain reaction

Smad4

mothers against decapentaplegic Homolog 4

TGF

tumor growth factor

VSMC

خلايا العضلات الملساء الوعائية

HUVSMC

human umbilical vein smooth muscle cell

CASMC

coronary artery smooth muscle cell

ترافق المعلومات التكميلية هذه الورقة على موقع الويب الخاص بموت الخلايا ومرضها (http://www.nature.com/cddis)